Новогоднее

Следующим прорывом журнал Science назвал успехи в выращивании (в пробирке) органоидов - миниатюрных подобий почки, печени и даже мозга, на которых можно изучать целый ряд важных биологических механизмов. Я подробно рассказывал об этом удивительном и перспективном достижении в статье «А не вырастить ли нам запасной мозг» («Окна», 5.12.2013). Еще об одном выдающемся прорыве года, по мнению журнала Science, - об открытии доселе совершенно неизвестной системы очистки мозга (глимфатической системы) и роли сна в такой очистке - я тоже подробно рассказывал в статье «Тайная жизнь мозга» («Окна», 12.12. 2013). Далее в списке важнейших открытий минувшего года журнал называет обнаружение источников космических лучей (этим источником оказались взрывающиеся сверхновые звезды), открытие замечательных свойств минерала перовскита как суперэффективного (в перспективе) материала солнечных батарей и установление того факта, что живущие в человеческом организме бактерии играют жизненно важную роль в том, как организм реагирует на стресс и другие угрозы вплоть до рака.

Наконец, самым важным в практическом (медицинском) плане мне представляется создание методами структурной биологии вакцины против респираторного синцитиального вируса (РСВ) – этой основной причины инфекции нижних дыхательных путей у новорожденных и детей. Еще недавно в энциклопедической справке об РСВ писалось, что «вакцины от этого вируса не существует». Но вот в мае 2013 года ученые из американского Института аллергий и инфекционных заболеваний сообщили, что им удалось выявить полную пространственную структуру РСВ и найти на нем тот белковый «бур», которым этот вирус ввинчивается в клетку легочной ткани. Мало того, им удалось кристаллизовать этот белок, найти его атомарную структуру и по этим данным синтезировать его в пробирке, а затем ввести животным. Результатом было появление в крови животных антител против РСВ, которые по своей терапевтической мощности в 100 (!) раз превосходят ныне применяемое лекарство паливизумаб (стоящее 1000 долларов за дозу). Сейчас этот структурно-биологический метод уже взят на вооружение тремя группами ученых, которые надеются найти таким же образом вакцину против вируса ВИЧ (возбудителя СПИДа).

А теперь, сказав бегло о восьми фундаментальных научных прорывах года по списку журнала Science, я позволю себе вернуться к первым двум (ибо они связаны друг с другом) – к разработке методов генетической микрохирургии и применению этих методов для разработки революционно нового и многообещающего метода борьбы с раковыми заболеваниями.

До недавнего времени основным методом борьбы с раком были хирургия, облучение и химиотерапия. С недавних пор появились как минимум два новых. Об одном я много раз рассказывал на этих страницах. Это медицинская нанотехнология, которая предлагает все новые и новые наночастицы, несущие в себе или на себе некие молекулы, призванные атаковать раковые клетки снаружи или изнутри. К сожалению, такие наночастицы, отлично справляясь со своим делом в пробирке, пока что затрудняются найти нужную мишень (и только ее) в живом организме. Много более обнадеживающие результаты уже сейчас демонстрирует другая методика, по-русски именуемая ультразвуковой абляцией (от слова ablate, что значит «удаление») и состоящая в том, что раковую опухоль, выявленную различными путями (в мозгу, например, с помощью fMRI), удаляют с помощью нагрева высокоинтенсивным и остро сфокусированным пучком ультразвуковых волн. Такой пучок нагревает микроучасток ткани до 65-85 градусов, и клетки на этом участке погибают (большие опухоли удаляют пошагово). Недавно такую операцию без операции (на мозге) впервые в истории израильской медицины осуществили в больнице «Рамбам».

Этот метод борьбы с раком уже официально одобрен в ряде стран Западной Европы, Азии, Австралии, в США и в Израиле, а более простой, с наводкой при помощи ультразвуковой локации опухоли, – в странах Восточной Европы и России. У него тоже есть ограничение – интенсивность луча нельзя сделать выше определенного предела, так как это вызовет образование и рост пузырьков газа, выделяющегося из межклеточной жидкости, а при лопании таких пузырьков образуются ударные волны, которые могут нагреть участок до сотен и даже тысяч градусов.

Оба эти метода борьбы с раком, равно как и многие прежние, при всем их различии имеют нечто общее. Все они направлены на борьбу с опухолью. Тот метод, который журнал Science назвал первым в числе научных прорывов 2013 года, принципиально отличается от них тем, что мишенью его является не опухоль, а иммунные клетки организма. Речь идет о такой модификации наших собственных иммунных клеток, которая заставляет их намного более энергично атаковать и уничтожать клетки рака. Поиск таких возможностей шел давно.

Уже в 1987 году французские исследователи обнаружили на поверхности одного из двух видов иммунных клеток, так называемых Т-клеток, призванных непосредственно распознавать и уничтожать вторгшиеся в организм патогены, некий ранее неизвестный белок (CTLA-4). Спустя несколько лет американский ученый Аллисон выявил, что этот белок несколько тормозит активность Т-клеток, и решил попытаться эту помеху убрать. В 1996 году он показал, что у мышей, которым введено вещество, блокирующее работу CTLA-4, исчезают раковые опухоли. Однако мысль о применении иммунотерапии для борьбы с раком не заинтересовала в то время большие фармафирмы, и только в 2010 году созданное по идее Аллисона средство снятия тормоза с Т-клеток было впервые испробовано на людях. Его применили для лечения пациентов с меланомой, и впервые в истории оно существенно удлинило срок жизни уже обреченных на смерть людей – около четверти терминальных пациентов прожили как минимум еще два года.

Почти одновременно с открытием блокатора CTLA-4 японские ученые обнаружили на Т-клетках другой аналогичный блокатор - PD-1, а затем онколог Пардолл из американского университета Джона Хопкинса нашел антивещество против него и убедил медиков испробовать его в клиническом испытании. Оно было проведено в 2006-2008 годах на 39 больных с пять разными видами рака и в случае легочных опухолей показало заманчивые результаты: у пяти больных опухоли стали уменьшаться, а выживание нескольких других намного удлинилось.

Интересно, что воздействие этих анти-CTLA-4 и анти-PD-1 на разных пациентов протекает по-разному: у некоторых опухоли перед исчезновением, напротив, растут, а у некоторых воздействие лекарства продолжается и по окончании испытания, свидетельствуя об устойчивой активизации их иммунной системы. Тем не менее итоги испытаний оказались настолько перспективными, что в 2011 году лекарство ипилимумаб, основанное на анти-CTLA-4, было официально разрешено в США для лечения метастатических меланом (сегодняшняя цена такой иммунотерапии - 120 тысяч долларов за курс). Тем временем подоспели весьма ободряющие результаты широкой (на 1800 пациентах) клинической проверки этого лекарства, начавшейся три года назад.

Оказалось, что 22%, около 400 человек, благополучно прожили эти три года. Раньше такой результат считался бы чудом. Аналогичный результат показал препарат анти-PD-1: в ходе проверки на 300 больных опухоли уменьшились наполовину или больше у 31% пациентов с меланомой, у 29% пациентов с раком почек и у 17% пациентов с раком легких. А комбинация обоих «анти» привела к глубокой и быстрой регрессии опухолей почти у трети пациентов с меланомой.

Одновременно противораковая иммунотерапия развивалась и по-другому направлению, в котором эффективность Т-клеток была резко улучшена иным путем – с помощью своего рода генетической хирургии. Еще недавно такая хирургия считалась, и была, фантастикой, и это надолго отсрочило прорыв, намеченный еще в конце 1980-х годов иммунологом израильского Института Вейцмана Зелигом Эшхаром. Эшхар тогда предпринял попытку улучшить способность Т-клеток распознавать раковые клетки путем модификации Т-клеток. Ему это частично удалось, но техника таких модификаций была в то время так сложна и ненадежна, что успех Эшхара не получил продолжения.

Однако по мере развития методов введения в клетки нужных белков с помощью ослабленных вирусов такое продолжение стало возможным. Первым на этом пути был американский онколог Седеляйн. Он же дал модифицированным Т-клеткам название CAR, первая буква которого «С» была началом английского слова «химера», поскольку эта клетка сочетает в себе гены двух разных источников.

Седеляйн и последовавшие за ним другие ученые (Джун, Портер, Бреннер и Розенберг) сосредоточились на создании таких «химер», которые распознавали бы специфическую метку CD19 на поверхности В-клеток. (В-клетки – это вторая разновидность иммунных клеток в нашем организме, и они имеют склонность опасно размножаться во всех видах злокачественных В-лейкемий).

Ученые нашли белок (СD28), который распознает эту метку. Этот белок, или иммуноглобулин обычно располагается на поверхности В-клетки и состоит из двух химических цепей. Такой торчащий на поверхности клетки белок играет роль рецептора. Рецепторный белок проходит сквозь мембрану клетки, и если его наружная часть соединится с чем-нибудь снаружи, она передает сигнал об этом внутрь клетки. Так вот, экспериментаторы отрезали (химическим способом, конечно) наружную часть одного из рецепторов Т-клетки и «пришили» на ее место иммуноглобулин, взятый у В-клетки. Такая «химера» уже способна опознавать метку CD19.

Все это выглядит легко, но делается так сложно и с таким множеством промежуточных тонкостей, что потребовалось несколько лет, прежде чем ученым удалось приступить к клиническим испытаниям созданных ими химер. Для таких испытаний заранее создавался запас Т- и В-клеток, взятых у терминальных лейкемических больных, затем в лаборатории производилась описанная выше модификация Т-клеток с помощью СD28, взятых из В-клеток того же пациента, и созданные таким способом «химеры» возвращались обратно в организм пациента. В 2010 году были получены первые результаты. Сначала Розенберг сообщил о полном излечении одного из терминальных пациентов от лимфомы, а затем группа Джуна и Портера сообщила сразу о трех вылеченных от лейкемии, включая 6-летнюю Эмили Уайтхед, чья судьба взволновала всю Америку. Эти эффектные успехи привлекли внимание крупных фирм, и фронт поисков стал расширяться.

В 2012 году та же группа Джуна уже могла сообщить о результатах лечения новым методом 75 больных лейкемией, у 45 из которых произошла полная ремиссия. Впрочем, у некоторых болезнь потом возвратилась, и это один из примеров того, как многое еще остается неизвестным и даже непонятным самим ученым в этом новом методе. Он явно порождает большие надежды, но он не дает уверенности, потому что помогает одним больным и почему-то не действует на других. И даже там, где действует, иногда, как видим, отказывает потом. И хотя он очень эффективен для первичных больных, он куда менее эффективен для больных с метастазами. Одного нельзя отрицать – он весьма перспективен, хотя и требует дальнейших исследований. И можно надеяться, что антираковая иммунотерапия в конце концов станет еще одним важным орудием медицины.

Закончу свое «новогоднее» рассказом о последнем из прорывов года в списке декабрьского номера журнала Science. Здесь речь идет о столь же фантастической перспективе создания набора «молекулярных ножниц», с помощью которых исследователи смогут вырезать из наших ДНК любой ген, вставлять вместо одного гена другой или, по желанию, усиливать или подавлять работу любого гена. Легко понять, какие медицинские горизонты могут открыть такие «ножницы».

Строго говоря, первые возможности операций на ДНК ученые нашли уже несколько лет назад. Сначала были обнаружены белки-нуклеазы, способные разрезать ДНК. Затем было открыто особое семейство белков (так называемые «цинковые пальцы»), каждый из членов которого мог разрезать ДНК в каком-то строго определенном месте и тем самым удалить из нее нужный ген или его часть («сшивку» ДНК автоматически осуществляют затем другие белки в клетке). Еще позже были созданы искусственные подобия «цинковых пальцев» - ТАЛЕНы, которые оказались еще эффективнее. Но все эти методы генетической хирургии были довольно громоздкими и сложными. В начале 2013 года на смену им пришел новый метод, такой простой и эффективный, что за неполный год его успели перенять и внедрить многие лаборатории мира, которые с успехом уже применили его для операций на ДНК в десятках видах клеток человека, мышей, крыс, рыб, бактерий, дрозофил, червей, дрожжей, риса, пшеницы и так далее и так далее.

А началось все много раньше – в 1987 году, когда в ДНК бактерий были обнаружены места, где много раз повторялась одна и та же группа химических звеньев. Потом оказалось, что гены в этих местах, встроенные между повторами, похожи на гены бактериофагов (вирусов, паразитирующих на бактериях). Когда же выяснилось, что такие системы повторов, разделенных генами фагов, есть у 40% всех видов бактерий и 90% всех видов других простейших, архей, ведущий западный биоинформатик Евгений Кунин высказал предположение, что эти участки бактериальной ДНК играют роль иммунной системы.

Эта бактериальная иммунная система получила сокращенное название CRISPR. Как я уже сказал, это отрезок бактериальной ДНК, на котором цепь ДНК через равные промежутки прерывается встроенными в нее чужеродными вставками (спейсерами), каждый из которых представляет собой какой-то ген какого-то из видов бактериофагов.

Как они там оказались? Дело в том, что, атакуя бактерию, вирус впрыскивает в нее свою ДНК. Появление чужеродной ДНК вызывает атаку бактериальных нуклеаз (из особого семейства Cas), которые дробят ее на отдельные гены, и один из этих генов встраивается в бактериальную ДНК на отведенном для спейсеров участке. Эта процедура повторяется при каждый встрече с новым фагом, и каждый раз ген очередного фага встраивается в бактериальную ДНК с пропуском нескольких звеньев, чтобы не слиться с геном от предыдущего фага. Так в бактериальной ДНК образуется CRISPR - длинный ряд спейсеров, разделенных одним и тем же числом звеньев.

Как работает такая иммунная система? При появлении внутри бактерии ДНК нового фага в бактерии активируется механизм, который порождает копию всего этого ряда спейсеров в виде длинной молекулы (она называется РНК), а потом разрезает эту цепочку так, чтобы в каждом маленьком куске остался один спейсер (и соседние с ним разделительные звенья). Каждая из получившихся малых молекул (они называются срРНК) несет в себе (кроме разделительных звеньев) свой спейсер, то есть ген какого-то из тех вирусов, с которым бактерия уже встречалась. Одновременно бактерия начинает производить молекулы Cas. Эти молекулы соединяются с срРНК в атакующие комплексы, которые атакуют ДНК нового фага. Если ген в каком-то комплексе опознает себе подобный ген в ДНК нового вируса, он соединяется с ним, и это служит командой, по которой молекула Cas режет вирусную ДНК в этом месте. Таким образом срРНК служит «распознавателем», а Cas – «ножницами», а вся CRISPR в целом действительно выполняет функцию иммунной системы.

В августе 2012 года группа Дудны и Шарпентье впервые сумела применить этот метод бактериальной защиты для задач генетической хирургии. Они ухитрились синтезировать срРНК, распознающую определенный участок ДНК некого бактериального паразита, соединить эту срРНК с нуклеазой Cas9 (она оказалась в определенных отношениях самой эффективной из семейства Cas) и направить этот комплекс на ДНК паразита. Операция прошла успешно – ДНК плазмида была разрезана точно в нужном месте. Мало того, с помощью механизма «починки»ДНК экспериментаторам удалось встроить в место разреза другой ген, который известил о себе началом производства своего белка. Это было одновременно и известием о появлении нового метода генетической хирургии.

Новый метод оказался много проще и эффективнее прежних. В нем для целенаправленного разрезания ДНК использовались не белки (вроде «цинковых пальцев» или ТАЛЕНов), которые трудно синтезировать и нацеливать, а легко синтезируемые малые crРНК и готовые молекулы Cas. Уже через 5 месяцев после работы Дудны и Шарпентье американский биолог Чёрч показал, что их метод можно с успехом применить для направленной хирургии человеческой ДНК, и в доказательство синтезировал целую «библиотеку» разных crРНК для вырезания чуть ли не любого человеческого гена. И тогда же Чанг сумел создать такие комплексы crРНК+Cas, которые могли вырезать сразу 2 гена. А в сентябре 2012 года было найдено, как использовать тот же метод не для вырезания, а только для подавления или активации любого гена (в частности, были проделаны опыты с генами, которые связаны с некоторыми человеческими заболеваниями).

В результате новый метод чуть ли не мгновенно открыл перед учеными почти бескрайние перспективы любого нужного «редактирования» любых генов. Но надо оговориться: большинство этих успехов достигнуты пока в пробирке. Новый метод еще нуждается в разработке средств доставки хирургического комплекса в каждую нужную клетку живого организма (пока это сделано только для полосатой рыбки, в опытах с которой такие комплексы ввели в зародышевую клетку). Другое важное препятствие на пути медицинского внедрения нового метода состоит в его неоднозначности – уже обнаружено, что комплексы crРНК+Cas зачастую режут ДНК не только в нужном месте, но и в других, похожих, - а это, понятно, недопустимо в любой хирургии, тем более в генетической.

Так что прорывы прорывами, но они приносят не только поразительные успехи, но и необходимость новых исследований. Научный поиск продолжается, и хорошо, что продолжается, потому что только это может наградить нас новыми прорывами.

Источник: "Окна", 2 января 2013